在国家重点研发计划(2021YFC2100100)和国家自然科学基金(22378165)等项目资助下，best365体育官网平台吴静教授团队在挖掘天然老黄酶的新功能催化MBH反应研究方面取得进展。研究成果以“Unlocking the function promiscuity of old yellow enzyme to catalyze asymmetric Morita-Baylis-Hillman reaction”为题于2024年7月发表在Nature Communications杂志上。江南大学博士研究生王蕾为第一作者，best365体育官网平台宋伟副研究员为通讯作者。

Morita-Baylis-Hillman (MBH)反应是一种重要的C-C键形成反应，是指在合适的亲核催化剂催化下，活化烯烃(例如：α，β-不饱和羰基化合物)与碳亲电试剂(例如：醛)之间形成C-C键的原子经济反应，其产物具有广泛的生物活性，包括抗癌、降糖、抗炎、抗病毒、抗菌等。开发高效的酶催化MBH反应方法，将极大促进手性药物合成，推动制药工业的发展。该研究旨在探索利用老黄酶(old yellow enzymes, OYEs)的底物相似性，开发其催化反应的功能多样性。

(1)该研究首先基于MBH反应和OYEs还原反应的底物相似性，提出OYEs可能具有催化MBH反应的功能。通过质谱和光谱实验，证实了GkOYE等多种OYEs确实能催化MBH反应生成目标产物。随后，通过组分筛选实验，确定GkOYE蛋白是催化MBH反应的关键。这一发现首次在OYEs中揭示了催化MBH反应的杂泛性，为开发高效催化该反应的酶提供了全新思路。(2)为提高OYEs催化MBH反应的效率，作者分析了OYEs催化还原反应的分子机制，提出阻断H^-和H⁺转移途径以消除还原活性、放大MBH催化功能的策略。通过定点突变切断OYEs与FMN的相互作用，去除FMN辅因子阻断H^-转移；突变Y169F阻断H⁺转移。两种策略结合，获得了还原活性下降98.3%而MBH活性提高141.4%的GkOYE.8突变体。(3)为深入理解GkOYE催化MBH反应的分子机制，该研究通过定点突变、分子对接和动力学模拟等手段，系统阐明了关键催化位点及其作用机制。其中，C26可能作为亲核催化残基参与MBH反应，E59通过水介导的氢键网络去质子化C26巯基，增强其亲核性。这些结果系统阐释了GkOYE催化MBH反应的分子机制，为后续酶改造奠定了基础。(4)随后通过增强底物结合亲和力的策略进行蛋白质工程改造，获得了对映体互补的突变体GkOYE.11和GkOYE.13。其中，GkOYE.11的产率达77.8%，e.r.值为89:11；GkOYE.13的产率为63.1%，e.r.值为23:77。(5)最后，底物适用性实验表明GkOYE.11/13能接受多种芳香醛底物，优先接受对位取代的衍生物。这些结果标志着催化MBH反应的高效OYE变体的成功构建，为手性MBH产物的酶法合成提供了全新工具。

该研究首次在OYE家族中发现了催化MBH反应的，并通过阻断还原反应途径将其转化为主要催化功能，实现了催化选择性的逆转。随后，阐明了GkOYE催化MBH反应的分子机制，并通过定向进化获得的对映体互补的突变体GkOYE.11和GkOYE.13。GkOYE变体能接受多种芳香醛和烯烃作为底物，极大拓展了酶催化MBH反应的适用范围。这些发现为开发基于OYEs催化新反应的生物催化过程提供了新策略，有望加速非天然手性化合物的绿色合成。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-50141-2

课题组(微生物制造工程研究中心)链接：https://fmme.jiangnan.edu.cn/

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